皮肤刺激性评估是化妆品生物环境试验的核心内容之一，直接关联产品安全性与消费者健康。该流程通过模拟化妆品与皮肤的接触场景，系统评估受试物对皮肤的潜在刺激作用，是化妆品上市前必须完成的关键环节。本文将围绕试验流程的核心步骤展开，详细解析每一步的操作规范与技术要点。

试验前的基础准备

试验启动前需全面收集受试物信息，包括成分列表、理化性质（如pH值、溶解性、挥发性）、预期使用浓度及剂型（如霜剂、乳液、水剂）。这些信息直接影响后续试验设计，例如挥发性强的受试物需选择封闭型染毒，而酸性较强的产品需关注pH对皮肤的潜在影响。

接下来需依据法规要求（如我国《化妆品安全技术规范（2015年版）》、欧盟EC 1223/2009法规）设计试验方案，明确试验类型（急性或多次皮肤刺激）、动物模型、染毒参数及观察指标。例如急性皮肤刺激试验通常选择健康家兔，而多次刺激试验需延长染毒周期至14天。

设备与试剂的准备需提前完成校准与验证：脱毛器需确保不会损伤动物皮肤；封闭敷贴（如铝箔或塑料膜）需无刺激性；生理盐水用于清洁皮肤；评分标准卡需参照统一的分级系统（如Draize评分表），确保观察的一致性。

受试物的标准化处理

受试物需根据理化性质进行标准化处理，确保其在试验中保持稳定且符合实际使用场景。对于不溶性固体或半固体受试物（如粉质化妆品），需选择无刺激性载体（如凡士林、羊毛脂）稀释至规定浓度，载体的用量需确保受试物均匀分散，且不影响其皮肤接触性。

浓度调整需遵循“最坏情况”原则——若产品为稀释后使用（如沐浴露需稀释10倍），则试验需同时评估稀释前的浓缩液与稀释后的使用液；若为直接使用（如面霜），则以实际使用浓度为准。对于复方产品，需确认各成分的协同作用，若某成分单独具有刺激性，则需评估其在复方中的贡献，但试验仍以完整产品为受试物。

载体的选择需经过预试验验证：将载体涂抹于动物皮肤，观察24小时无刺激反应后方可使用。例如，水剂化妆品可直接用原剂型试验；软膏类化妆品需保持原质地，无需额外稀释；喷雾类产品需收集喷雾液，确保试验用样品与实际喷出物一致。

试验动物的选择与预处理

试验动物的选择需符合法规要求：急性皮肤刺激试验首选健康白色家兔（New Zealand White Rabbit），因其皮肤厚度与人类接近，反应明显；豚鼠（Guinea Pig）多用于多次刺激或致敏试验，因其皮肤对慢性刺激更敏感。

动物健康状态需严格筛查：家兔选择2-3kg、6-8周龄的个体，无皮肤疾病、外伤或感染；豚鼠选择300-500g、8-10周龄的个体。饲养条件需控制在温度20-25℃、湿度40-60%、12小时光照周期，饲料为专用粮，饮水充足。

适应性喂养是关键环节：试验前3-5天需将动物转移至试验环境，观察进食、饮水与排便情况，减少应激反应。皮肤预处理需用电动剃毛器去除背部两侧3×3cm区域的毛发，避免损伤皮肤；脱毛24小时后检查皮肤无红斑、水肿或破损，方可进入染毒环节。

皮肤染毒的操作规范

染毒部位选择动物背部两侧脱毛区，左侧为受试物区，右侧为对照区（空白对照用生理盐水，载体对照用受试物的载体）。对照区的设置用于排除非受试物因素（如载体、操作）的干扰，确保结果准确性。

染毒剂量需匹配动物体型：家兔每侧脱毛区涂抹0.5-1.0g软膏类受试物或0.5-1.0ml水剂，确保均匀覆盖无堆积；喷雾类产品需对准脱毛区10-15cm处喷雾2秒，用滤纸收集多余液体。染毒时间需模拟实际场景：封闭染毒（覆盖塑料膜固定）适用于停留型产品（如面膜），时长24小时；开放染毒（不覆盖）适用于冲洗型产品（如洗面奶），时长1-4小时后用生理盐水冲洗。

操作中需防止动物抓挠：可使用限制器或伊丽莎白圈，避免受试物被舔食或擦掉。若动物出现烦躁、舔咬等应激反应，需终止试验并更换个体，确保数据可靠性。

刺激反应的观察与量化评分

观察时间点需覆盖反应全程：急性刺激试验在染毒后1小时（即时反应）、24小时、48小时、72小时观察；多次刺激试验需每日染毒后24小时观察，结束后延长观察72小时。观察指标包括红斑（发红程度）、水肿（肿胀程度）及继发性反应（渗出、结痂、脱屑）。

量化评分采用统一标准（如Draize评分表）：红斑分为0（无）至4（紫红色伴表皮损伤）分，水肿分为0（无）至4（水肿伴渗出）分。评分需由2名观察者独立完成，取平均值；若差异超过1分，需第3名观察者复核。例如，轻微红斑（1分）+ 轻度水肿（1分）的PSI（原发性刺激指数）为1.0，属于轻度刺激。

继发性反应需详细记录：渗出液的颜色（清亮/浑浊）、结痂的大小、脱屑的范围，这些信息可补充说明刺激性的持续时间与严重程度。

皮肤组织学检查的补充验证

组织学检查用于揭示刺激的病理机制，采样时间选在反应最明显的节点：急性刺激试验72小时后，多次刺激试验结束后72小时。采样部位为受试物区与对照区的1×1cm全层皮肤，放入10%福尔马林固定24小时。

病理切片制作需遵循标准流程：脱水（乙醇梯度）、透明（二甲苯）、包埋（石蜡）、切片（5μm厚）、HE染色（苏木精染核、伊红染质）。镜下观察重点包括：表皮完整性（角质层脱落、棘细胞水肿）、真皮反应（血管扩张、炎性细胞浸润类型）、附属器损伤（毛囊变性、皮脂腺萎缩）。

结果需与评分对应：若评分显示轻度刺激，组织学应可见轻微血管扩张与少量淋巴细胞浸润；若评分显示重度刺激，组织学需出现表皮坏死、大量中性粒细胞浸润，两者一致方可确认结果。

结果的统计与判定

统计指标需结合观察与组织学结果：急性刺激试验计算“原发性刺激指数（PSI）”，公式为（红斑平均分+水肿平均分）/2；多次刺激试验计算“累积刺激指数（CSI）”，即每次评分的平均值。

刺激性分级参照法规：PSI≤0.5为“无刺激性”，0.6-2.0为“轻度刺激性”，2.1-4.0为“中度刺激性”，>4.0为“重度刺激性”。例如，某面霜PSI为1.2，判定为轻度刺激，需标注“敏感肌慎用”；若PSI为4.5，则禁止上市。

可靠性验证是最后一步：若首次试验结果为中度或重度刺激，需用同一批次受试物重复试验，两次结果差异≤0.5方可确认；若评分与组织学结果矛盾，需重新检查试验操作（如染毒剂量、观察时间），调整后再次评估。