在环境可靠性检测中，霉菌测试是评估产品抗霉性能的核心项目，直接关联电子、建材、纺织等产品在潮湿环境下的使用寿命与安全性。而菌种培养作为霉菌测试的基础环节，其规范性直接影响测试结果的准确性——只有保证菌种活性、纯度与代表性，才能模拟真实环境中的霉菌侵害情况。本文将从菌种选择、培养基制备到培养控制等关键环节，系统解析霉菌测试菌种的专业培养方法。

霉菌测试菌种的选择原则

霉菌测试菌种需严格遵循《GB/T 2423.16-2018 环境试验 第2部分：试验方法 试验J及导则：长霉》《IEC 60068-2-10:2005》等标准。首要原则是“生态代表性”：选择自然界中广泛存在的腐生霉菌（如黑曲霉、青霉），这类菌种能真实反映产品实际使用环境中的霉菌污染风险。

其次是“材料针对性”：不同材料的敏感霉菌不同——木材、纸制品需选能分解纤维素的木霉（Trichoderma spp.）；塑料、橡胶需选能降解高分子的黑曲霉；食品包装需考虑产毒的黄曲霉（Aspergillus flavus）。此外，菌种需具备遗传稳定性，避免因变异导致测试结果波动。

常用霉菌测试菌种的特性

黑曲霉（Aspergillus niger）是最常用的测试菌种：菌落呈黑色绒毛状，边缘白色，生长速度快（2-3天可覆盖平板），能分泌纤维素酶、淀粉酶等，对塑料、涂料、皮革等多种材料有强破坏性。

黄曲霉（Aspergillus flavus）：菌落初期为黄色，后期转为黄绿色，能产生黄曲霉毒素，对有机材料（如食品包装纸、橡胶）的降解能力强，常用于食品接触材料的霉菌测试。

青霉（Penicillium spp.）：菌落呈青绿色，绒毛状，常见于潮湿的墙壁、纸张表面，能分泌青霉素类物质，对涂料、胶粘剂的破坏显著，是建筑材料霉菌测试的核心菌种之一。

木霉（Trichoderma spp.）：菌落为绿色或白色，菌丝呈棉絮状，能高效分解纤维素，是木材、竹制品霉菌测试的必选菌种——其分泌的纤维素酶可快速破坏木材结构，导致材料发霉、变软。

霉菌培养用培养基的类型与选择

霉菌培养的核心是选择适配的培养基，常用类型包括：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、萨氏培养基（SDA）、察氏培养基（Czapek-Dox Agar）。

PDA是基础通用培养基：成分简单（马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、水1000ml），营养丰富，适合大多数霉菌（如黑曲霉、青霉）的生长，是菌种活化、复壮的首选。

萨氏培养基（SDA）：含2%葡萄糖、1%蛋白胨，因高糖环境能抑制细菌生长，常用于霉菌的分离纯化（如从污染样品中分离单菌落），适合需要排除细菌干扰的测试场景。

察氏培养基：成分明确（硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、琼脂15g、水1000ml），不含复杂有机物，常用于霉菌的生理生化研究（如观察孢子形态），适合对菌种代谢能力要求高的测试。

霉菌培养基的标准化制备流程

以PDA为例，制备需遵循以下步骤：1、原料处理：马铃薯去皮切块（约2cm³），加500ml水煮沸30分钟（用纱布过滤取汁，补足水至1000ml）；2、配料：加入葡萄糖20g、琼脂15g，加热搅拌至完全溶解。

3、调pH：用1mol/L盐酸或氢氧化钠将pH调至5.5-6.0（霉菌喜酸性环境）；4、灭菌：121℃高压灭菌20分钟（灭菌后需快速冷却至45-50℃，避免琼脂凝固）；5、倒平板：将培养基倒入无菌培养皿（每皿15-20ml），待凝固后倒置保存（4℃冰箱可存1周）。

注意事项：灭菌时需将培养基充分摇匀，避免琼脂沉淀；倒平板时需在超净工作台内操作，防止空气中的杂菌污染；若培养基出现凝固、浑浊或异味，需丢弃重新制备。

接种前的无菌环境与器械准备

无菌操作是避免菌种污染的关键。首先是环境准备：超净工作台需提前30分钟开启紫外灯灭菌（波长254nm，照射距离≤1m），用75%乙醇擦拭台面、培养皿外壁；无菌室需定期用福尔马林熏蒸（每立方米空间用10ml福尔马林+5g高锰酸钾），确保空气菌落数≤10 CFU/皿。

器械准备：接种针、涂布棒需在酒精灯火焰上灼烧灭菌（从针柄到针尖全部烧红，冷却30秒后使用）；移液器枪头需用一次性无菌枪头；菌悬液需用0.85%无菌生理盐水配制（避免高渗环境影响孢子萌发），浓度控制在10^6-10^7 CFU/ml（用血细胞计数板计数）。

菌种复苏：从斜面保藏的菌种需提前活化——挑取少量菌丝或孢子，接种到新鲜PDA平板上，25℃培养2-3天（待菌落直径达2-3cm时使用），确保菌种处于对数生长期。

霉菌菌种的接种操作方法

涂布法：适用于定量测试（如菌落计数）。取0.1ml菌悬液滴加至平板中心，用无菌涂布棒以“顺时针-逆时针”方向均匀涂抹（涂布棒需轻压平板，避免划破培养基），每板涂1次，涂后倒置培养。

点植法：适用于观察菌落形态。用接种针挑取少量孢子（约芝麻大小），点种在平板上（每板点3-5个点，点距2cm），适合黑曲霉、黄曲霉的菌落特征观察——点植法能让菌落充分生长，便于记录形态、颜色变化。

划线法：适用于菌种纯化。用接种环蘸取菌悬液，在平板上做“Z”字形划线（第一区划线密，第二区稀疏），每划一区后灼烧接种环，避免杂菌干扰。培养后，划线末端会出现单菌落，挑取单菌落即可获得纯菌种。

霉菌培养过程的环境参数控制

温度：霉菌最适生长温度为25-28℃（如黑曲霉25℃、黄曲霉28℃），温度过高（＞30℃）会抑制孢子萌发，过低（＜20℃）会减慢生长速度。需用恒温培养箱（精度±1℃）控制温度。

湿度：霉菌需要高湿度（＞85%），否则菌丝会干燥死亡。可在培养箱内放置盛有蒸馏水的托盘（水面高度≤2cm），或用恒温恒湿培养箱（湿度精度±5%）。若用普通培养箱，需每天向托盘加水，保持湿度稳定。

光照：大多数霉菌（如黑曲霉、青霉）不需要光照，黑暗环境更利于孢子萌发。若培养箱有光照功能，需关闭或调至弱光（＜500lux），避免光照影响菌丝生长。

霉菌菌种纯度的检测方法

菌落形态观察：纯菌种的菌落形态一致——如黑曲霉的菌落为黑色绒毛状，边缘白色；黄曲霉为黄绿色，菌落厚密；若出现其他颜色（如红色、灰色）或形态（如黏液状）的菌落，说明有杂菌污染。

显微镜检查：挑取少量菌丝或孢子，用乳酸酚棉蓝染色（染色液配方：乳酸20ml、酚20g、棉蓝0.05g、蒸馏水20ml），制片后在光学显微镜（400×）下观察——黑曲霉的分生孢子梗为褐色，顶囊呈球形，小梗上有黑色孢子；黄曲霉的顶囊为烧瓶形，孢子呈黄色。若观察到其他形态的菌丝（如杆菌、球菌），即为污染。

霉菌菌种的保藏与复壮技巧

斜面保藏：将活化好的菌种接种到PDA斜面（试管倾斜45°，让培养基形成斜面），25℃培养3-5天（待长出孢子），用石蜡密封试管口（石蜡需融化后冷却），4℃冰箱保存（可存6-12个月）。使用前需复苏：挑取少量孢子接种到新鲜斜面，培养2-3天。

冷冻干燥保藏：将菌悬液（10^8 CFU/ml）与保护剂（10%脱脂乳粉）按1:1混合，装入安瓿瓶，冷冻干燥（-50℃，真空度10-20Pa）后密封，-20℃保存（可存5-10年）。复苏时需用无菌水溶解冻干粉，接种到PDA平板。

复壮：若菌种出现生长缓慢、孢子量减少（如黑曲霉菌落颜色变浅），需进行复壮——将菌种接种到新鲜PDA平板，连续转接3次（每次培养2-3天），可恢复菌种活力。

菌种培养中常见问题的排查与解决

问题1：培养基污染（出现杂菌菌落）——原因：培养基灭菌不彻底（如温度未达121℃）、倒平板时操作不当（未在超净台内）。解决：重新制备培养基，严格无菌操作。

问题2：菌种生长缓慢（3天未长出菌落）——原因：温度过低（＜20℃）、湿度不够（＜80%）、菌种老化。解决：调整培养箱温度至25-28℃，增加湿度，更换新鲜活化的菌种。

问题3：孢子量少（菌落无明显孢子）——原因：培养时间不足（＜3天）、培养基营养不足（如葡萄糖含量低）。解决：延长培养时间至5-7天，更换PDA培养基（增加葡萄糖至25g/L）。